CaniLeish: è arrivato il vaccino europeo anti-Leishmania

Disclaimer medico

Come ha affermato la Virbac™ in un comunicato stampa del 17.03.2011, il Comitato per i prodotti medicinali veterinari (CVMP) dell’Agenzia europea dei medicinali (EMA) il 13.01.2011 ha concesso parere positivo per la registrazione (e l’autorizzazione all’immissione in commercio) del vaccino CaniLeish®, confermandolo definitivamente il 14.03.2011. Il 06.04.2011 l’EMA ha pubblicato i dettagli dell’autorizzazione: alla pagina sono disponibili alcuni documenti PDF che al momento rappresentano l’unica fonte d’informazione sul presidio (informazioni per il pubblico) e sulla documentazione presentata dalla ditta al CVMP, così come le motivazioni del parere favorevole dello stesso Comitato, contenute nel Public assessment report (Discussione scientifica, 04.04.2011, EMA/CVMP/296057/2010). Il documento, strutturato in parti standard in cui viene presentato e valutato il dossier della ditta richiedente, è composto dai seguenti capitoli: sintesi del fascicolo, certificazione di qualità, valutazione della sicurezza, valutazione dell’efficacia, valutazione rapporto beneficio/rischio. Si cerca di riassumere/tradurre le parti più importanti, integrandole, ove possibile e pertinente, con altre informazioni; la suddivisione semplificata in paragrafi e sottoparagrafi che faccio qui sotto non riflette precisamente quella del documento del CVMP in cui è facile perdersi.

Lo schema vaccinale prevede 1 iniezione in cani con più di 6 mesi d’età, da ripetere dopo 3 settimane e poi dopo altre 3 settimane (vaccinazione di base); altra iniezione (vaccinazione completa) dopo 1 anno e poi una singola iniezione una volta all’anno.
Secondo quanto comunicato stringatamente dalla Virbac™, il vaccino verrà lanciato dapprima in Portogallo alla fine della prima metà del 2011, poi rapidamente anche in Spagna, Francia, Grecia e Italia (non in ordine cronologico).


Composizione del vaccino:

La ricerca, che ha avuto origine all’Institut de Recherche pour le Développement (IRD) (Montpellier, Francia), è stata incentrata sulle proteine escrete/secrete (ESP) di Leishmania (LiESAp). Queste proteine sono state identificate in diversi protozoi parassiti e sono caratterizzate da funzioni critiche durante il ciclo biologico del parassita (interazione con la cellula ospite, sviluppo intracellulare del parassita, modulazione della risposta immunitaria dell’ospite). È stato brevettato un terreno di coltura privo di siero. Questo terreno ben definito consente la crescita e il mantenimento di L. infantum essendo privo di cellule, siero, macromolecole (proteine ed acidi nucleici) e peptidi. Da questo terreno è stato isolato il surnatante con le ESP derivate dal parassita durante la crescita. Le sole proteine presenti nel terreno sono di origine parassitaria e presentano la loro conformazione nativa in quanto sono naturalmente escrete/secrete da Leishmania (1, 2). L’adiuvante utilizzato, estratti purificati di Quillaja saponaria, è stato scelto per le proprietà immunostimolanti, in quanto induce una forte risposta immunitaria di tipo 1 (Th1), mediata soprattutto dalle citochine IFN-, IL-2 e dall’attivazione dei linfociti T (LT) citotossici; questo tipo di risposta è ritenuto fondamentale per lo sviluppo di un vaccino efficace contro la leishmaniosi; la dose dell’adiuvante è stata stabilita sulla base di diversi studi preliminari sull’efficacia e la sicurezza.

Per quanto riguarda le caratteristiche di sicurezza del vaccino, sono state valutate in due studi di laboratorio (in cani Beagle). Nel primo, i gruppi dei cani vaccinati e dei controlli erano rappresentati da soggetti di circa 4 mesi d’età (16-17 settimane), tutti sieronegativi (IFAT) all’inizio della prova. Il lotto del vaccino conteneva 120 microgr. di ESP/ml ed è stato inoculato SC in 4 dosi a distanza di 21 giorni; i soggetti sono stati esaminati (condizioni generali e locali del sito di inoculo) 4 ore dopo ogni dose e giornalmente per 14 giorni, e pesati una volta alla settimana a partire dal giorno (“D” da qui in poi) 7 fino alla fine del follow-up (D77). Sono stati considerati con ipertermia i soggetti con temperatura rettale superiore a 39,6 °C. Sono stati fatti prelievi di sangue -- al D0, D3, D8 e una volta alla settimana fino al D77 -- per le analisi ematologiche (emocromo). Nei cani vaccinati sono stati osservati solo segni leggeri e transitori (rigonfiamento e, in alcuni soggetti, noduli), che comparivano entro le prime 24 hh e si risolvevano entro 12 giorni di osservazione. Dopo la vaccinazione, in 2 soggetti su 10 è stata riscontrata una leggera e transitoria ipertermia. I due gruppi non hanno manifestato alcuna differenza statisticamente significativa per il peso corporeo ed i parametri ematologici. Tutti i cani sono rimasti sieronegativi (titolo < 80). Le conclusioni del CVMP sono che lo studio (4 vaccinazioni invece delle 3 raccomandate nello schema vaccinale, in cani più giovani dell'età minima raccomandata e con un sovradosaggio) ha dimostrato che la vaccinazione non determina gravi effetti collaterali. Nel secondo studio sono stati utilizzati cani e lotto vaccinale come nel precedente. Lo schema vaccinale ha previsto il sovradosaggio con 2 dosi di vaccino al D0 ed il follow-up è stato simile al precedente. I soggetti non hanno manifestato alcuna alterazione generale. Localmente invece il 70% dei vaccinati ha manifestato un rigonfiamento (diametro 2-7 cm) tra 4 hh dopo l'iniezione ed il D2 e che scompariva entro 5 giorni, ma non sono stati evidenziati né noduli né dolore; il 30% ha presentato una leggera ipertermia al D1 per 1 giorno (questi soggetti hanno presentato altri episodi leggeri e transitori d'ipertermia probabilmente a causa dell'agitazione) ma senza differenza statistica della temperatura tra i gruppi, così come per il peso corporeo ed i parametri ematici (nei limiti normali). Anche in questo caso tutti gli animali sono rimasti sieronegativi. Le conclusioni del CVMP sono analoghe al precedente (1). La valutazione della sicurezza è stata eseguita anche in uno studio di campo: cani di 51 razze diverse, di età superiore a 4 mesi, in 28 località francesi. Il vaccino è stato formulato a 110 microgr. di ESP/ml e sono state eseguite 3 inoculazioni a 3 settimane d'intervallo (D0, D21, D42); all'inclusione sono state eseguite analisi ematologiche e sierologiche (IFAT) seguiti poi da svariati controlli (fino al D56) generali e locali così come della temperatura e del peso (alcuni di questi controlli sono stati fatti dai proprietari a casa). Tutti i cuccioli hanno preso peso regolarmente durante tutto lo studio, a parte uno che però non ha presentato altri segni clinici generali; il peso medio degli adulti è rimasto stabile. Nei cani delle diverse razze il vaccino non ha indotto alcun effetto collaterale specifico diverso da quelli già osservati negli studi di sicurezza sui Beagle: reazioni locali come gonfiori, noduli, dolore alla palpazione o eritema, ipertermia, apatia e disturbi digestivi. Per quanto riguarda lo stato d'infezione da Leishmania all’inizio dello studio, quanto riportato dal CVMP non è molto chiaro: prima viene affermato che tutti i cani all’inclusione avevano un titolo IgG anti-Leishmania negativo ((1) pag. 17), e poi che al momento della prima iniezione circa il 15% dei cani era Leishmania-positivo ((1) pag. 18; non si capisce se e quanto tempo possa essere passato tra inclusione e prima iniezione o se si tratta di una positività diversa dalla sierologica, tipo alla PCR). Comunque la maggior parte di questi soggetti non ha presentato effetti collaterali; quelli che li hanno presentati non hanno subito conseguenze sostanzialmente diverse dai soggetti negativi. E questa sostanziale sicurezza è stata in seguito confermata anche negli studi d’efficacia di campo, con effetti che sono rimasti nel range accettabile per un vaccino canino (1).

Visto che il vaccino non è destinato all’uso in animali gravidi, non è stato condotto alcuno studio in questi cani (per cui il prodotto è da intendersi specificamente controindicato). Il processo produttivo ed i relativi controlli garantiscono l’assenza di microrganismi vivi nel prodotto finale. Per cui CaniLeish è considerato un vaccino inattivato in merito alla sicurezza di chi lo somministra ed all’impatto ambientale. Data dunque la natura del vaccino, sono possibili solo effetti collaterali dell’auto-inoculazione accidentale dell’adiuvante e non c’è motivo di considerarli diversi da quelli locali nei cani; tra l’altro le saponine vengono comunemente utilizzate in cosmetici e farmaci e del resto il rischio professionale in questo senso è remoto anche perché il vaccino verrà somministrato da parte dei medici veterinari.

Prima di entrare nel dettaglio della parte del dossier riguardante le prove di efficacia, il CVMP fa una lunga introduzione (che in questa sede è quasi interamente pleonastica), evidentemente in linea con la documentazione ricevuta dalla ditta richiedente. Un vaccino contro la leishmaniosi canina dovrebbe essere in grado di indurre un’immunità cellulomediata forte e di lunga durata. Durante tale risposta le cellule dendritiche dermiche migrano nei linfonodi tributari per presentare gli antigeni derivati da Leishmania ai linfociti T CD4 e CD8, i quali si accumulano nelle lesioni infiammatorie in via di sviluppo, promuovendo la distruzione del parassita, attraverso la produzione di citochine in grado di attivare la difesa macrofagica. La vaccinazione può promuovere tali risposte se gli antigeni vaccinali vengono somministrati in modo da attivare entrambe le sottopopolazioni linfocitarie. Un certo orientamento della risposta immunitaria è stato ampiamente implicato nell’evoluzione dell’infezione verso la progressione o la resistenza. La resistenza alla malattia sembra essere associata ad una risposta mista Th1/Th2 con la predominanza delle citochine Th1 (IFN-, TNF-, IL-2, IL-3, IL-12) e delle IgG2, mentre la malattia attiva è caratterizzata da una marcata risposta umorale. La vaccinazione in oggetto si basa sulla somministrazione di proteine alla base della risposta LT-dipendente. L’adiuvante è stato scelto perché in grado di intervenire in quest’orientamento della risposta immunitaria. La ditta richiedente ha scelto di focalizzare l’attenzione sui seguenti parametri: IgG, IgG1, IgG2 e risposta cellulomediata. Il postulato alla base della valutazione dell’efficacia del vaccino è che deve essere indotta una risposta mista Th1/Th2 per ottenere la protezione (1).

Nel dossier la dimostrazione dell’efficacia del vaccino si è basata su:

Uno studio pilota su cani seguiti per circa 2 anni, con la valutazione dell’effetto protettivo della vaccinazione nei confronti dell’infezione attiva (che è diversa dalla semplice infezione, NdW) e della malattia; 
L’effetto protettivo della vaccinazione in seguito ad un tentativo d’infezione sperimentale, basandosi sulla valutazione della risposta immunitaria dei cani vaccinati e la rilevazione del parassita dopo la prova (studio sulla durata dell’immunità). 
A supporto di questa dimostrazione, la ditta richiedente ha anche indagato la risposta Th1 dei cani vaccinati, in relazione ai parametri in vitro collegati alla risposta cellulare: attività leishmanicida dei macrofagi, saggio di proliferazione linfocitaria, IgG2 anti-ESP (1).

Considerando le difficoltà di riprodurre l’infezione e la malattia in laboratorio (i modelli sperimentali), su cui basare prove attendibili, i dati chiave per la dimostrazione dell’efficacia di questo vaccino si basano sulla prova di campo che ha interessato cani mantenuti in zone endemiche (studio in condizioni naturali) e seguiti nel corso di 2 anni. La scelta dello schema vaccinale del CaniLeish® si è basata su quello dell’unico vaccino (Leishmune®, Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Brazil, NdW) che era in commercio (in Brasile) al momento della progettazione e dell’inizio degli studi. Inoltre tra le diverse preparazioni vaccinali provate di cui ci sono dati in letteratura, quelle che prevedono 3 iniezioni invece che 2, sono risultate più promettenti.

L’efficacia del CaniLeish® è stata testata in una prova d’esposizione naturale a L. infantum in 3 aree altamente endemiche del bacino del Mediterraneo: una in Italia (Napoli) e due in Spagna (Barcellona e Ibiza). I tre sotto-studi hanno seguito lo stesso piano: la fase della vaccinazione primaria in condizioni di laboratorio controllate e protette e la fase dell’esposizione naturale al parassita nelle aree ad alta endemia nel corso di 2 stagioni (di trasmissione).

Efficacia di CaniLeish^® nei confronti dell’infezione naturale da Leishmania in Spagna e Italia

Nella prima fase della vaccinazione in laboratorio i cani sono stati mantenuti in condizione da prevenire ogni possibile contatto con Leishmania; nella seconda fase dell’esposizione naturale i cani (vaccinati e controlli) sono stati tenuti in canili all’aperto in aree endemiche. Si è trattato di uno studio multicentrico in cui sono stati inclusi Beagle provenienti da 3 canili ed esposti all’infezione naturale in 3 posti scelti in base alla situazione di endemia per leishmaniosi. I soggetti, controllati prima della vaccinazione in modo che fossero privi di anticorpi anti-Leishmania e di parassiti, avevano un’età da 5 a 9 mesi (6 mesi è l’età minima raccomandata per la vaccinazione). I cani sono stati assegnati a caso ai due gruppi dei vaccinati e dei controlli, tenendo in considerazione l’età, il peso e la cucciolata ((1): non si capisce in che senso, NdW), controllando che ne fosse rispettata l’omogeneità (1).

Quali sono le fase della vaccinazione?

Animali: Beagle di 5-9 mesi, assegnati in numero uguale ad ogni sotto-studio (Napoli, Barcellona e Ibiza), sieronegativi per Leishmania ed Ehrlichia; 
Vaccino: lotti standard (110 microgr. di ESP) per la vaccinazione primaria e per i boost annuali; 
Schema vaccinale: in ciascun sotto-studio gli animali sono stati suddivisi in 23 vaccinati (3 iniezioni: D0, D21 e D42 + una boost 1 anno e 2 anni dopo la terza iniezione della vaccinazione primaria) e 22 controlli; 
Indagine: nel follow-up clinico è stata controllata la temperatura rettale e sono state quantificate le IgG1 e le IgG2 anti-ESP e -PSA (ELISA) al D0, D21, D42 e D56, le IgG anti-Leishmania (IFAT) al D0 e al D56; 
Risultati: in seguito alla vaccinazione non è stata osservata alcuna reazione generale dovuta al vaccino; in alcuni casi è stata osservata una reazione locale nel sito d’iniezione (un rigonfiamento talvolta associato ad arrossamento, dolore o crosta) che si è risolta spontaneamente entro qualche giorno. I cani erano privi di Ac contro le proteine vaccinali e l’intero parassita prima dell’inizio dello schema vaccinale; tutti i controlli lo sono rimasti. La fase della vaccinazione primaria ha indotto una risposta immune analoga nei 3 sotto-studi: una risposta mista IgG1/IgG2 contro ESP ed una prevalente risposta IgG2 contro PSA. I cani hanno anche sviluppato IgG contro l’intero parassita (IFAT) ed è stata osservata anche una risposta cellulare specifica (la linfoproliferazione e la produzione di IFN- sono aumentate significativamente nei gruppi vaccinati) (1).

Le ESP rappresentano il principio attivo del vaccino. Il PSA (Promastigote Surface Antigen) è il principale costituente immunodominante attivo delle ESP e corrisponde ad un range di massa molecolare tra 52 e 58 KDa (3).

Fase dell’esposizione naturale

Esposizione naturale: un mese dopo l’ultima iniezione vaccinale (M0) i cani sono stati trasferiti in canili nelle aree endemiche per essere esposti al flebotomo vettore; tutti i soggetti sono risultati negativi alla PCR ed alla coltura (M0); 
Indagine: nel corso di 2 anni è stato valutato: IgG1 e IgG2 anti-ESP (ELISA) -- M0, M3, M9, M11, M12, M18, M23, M24 -- e l’immunità cellulare e, in due luoghi, anche l’attivazione dei linfociti T. L’entità dell’esposizione a Leishmania è stata valutata tramite: 
PCR nested (nPCR) e PCR real-time (rtPCR) su midollo osseo (M0, M9, M12, M15, M18, M21, M24, M25) ed isolamento in coltura da aspirati midollari o linfonodali (M0, M9, M15, M18, M21, M24); 
Visite cliniche per valutare eventuali segni compatibili con leishmaniosi; 
IFAT omologhi ed eterologhi per valutare i livelli di IgG anti-Leishmania (M0, M3, M6, M9, M11, M12, M15, M18, M21, M23, M24); 
Analisi ematologiche e biochimiche (emocromo e rapporto albumina/globuline [M0, M3, M9, M12, M15, M18, M21, M24]); 
Valutazione del punteggio clinico (il documento non è molto chiaro) in due categorie: soggetti con punteggio < o uguale a 3 e quelli con punteggio >3, assegnando 1 per ogni alterazione emato-biochimica (come leucopenia, anemia e/o trombocitopenia, iperproteinemia e/o iperglobulinemia) ed ogni segno clinico (come alterazioni cutanee, linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni oculari, artrite); 
Altri dati: 9 cani sono stati persi per cause estranee alla vaccinazione o alla leishmaniosi. Per cui sono stati valutati 65 vaccinati e 61 controlli; 
Significatività statistica: p < o uguale a 0,05; 
Considerazioni: negli studi la valutazione dei vari biomarker (proliferazione in vitro dei LT, produzione di IFN-, attività macrofagica di killing associata alla produzione di ossido nitrico [NO], risposta delle IgG [totali,1 e 2], DTH [LST]) ha rivelato un profilo immunologico costante e riproducibile nei cani vaccinati, ovvero: una prevalente risposta IgG2 anti-PSA, una risposta mista IgG1/IgG2 anti-ESP, un aumento dell’attività leishmanicida macrofagica ed uno specifico miglioramento della linfoproliferazione e della produzione di IFN-. Ma il CVMP riporta anche che non è stato possibile identificare un profilo immunologico diverso nei cani vaccinati che hanno sviluppato l’infezione persistente rispetto a quelli resistenti (1). 
La definizione dello stato dei cani nei confronti della leishmaniosi (o dell’infezione) è un punto fondamentale per l’interpretazione dei dati d’efficacia e la valutazione dell’efficacia del vaccino. La ditta richiedente ha fornito una spiegazione dei dati ed una definizione aggiornata per lo stato dei cani esposti alla malattia (o all’infezione):

EMA: EMA/CVMP/296057/2010 - EPAR - Public assessment report, CaniLeish Scientific discussion (April 2011)

La classificazione proposta è stata considerata accettabile anche perché è descritta in letteratura (1, 4). I dati degli studi di campo confermano che un cane che come alterazione ha la sola PCR positiva (infezione subclinica) può andare incontro a negativizzazione, mentre se e quando l’infezione diventa attiva, il sistema immunitario non è più in grado di opporsi alla moltiplicazione attiva del parassita e lo stato del soggetto passa dalla fase asintomatica ad un periodo più o meno lungo di malattia sintomatica (1).

Tassi d’esposizione

Il tasso d’esposizione è stato stimato dalla percentuale dei controlli positivi a Leishmania almeno una volta:

• Napoli: 89%;
• Barcellona: 55%;
• Ibiza: 14%.

Tassi d’esposizione importanti sono stati ottenuti a Napoli e Barcellona, mentre a Ibiza è stato rilevato un tasso molto basso e questo può essere dovuto a diversi motivi: condizioni climatiche avverse al vettore, calendario di studio (i cani sono stati trasferiti nel luogo, nella prima stagione, più tardi rispetto a quando previsto), utilizzo di insetticidi ed acaricidi ambientali e topici. Questo sito è stato considerato differente ed i dati di Ibiza sono stati esclusi dall’analisi finale dei risultati (1).

Risultati

• Considerando i siti di Napoli e Barcellona, approssimativamente il 57% dei cani vaccinati ed il 72% dei controlli sono risultati positivi a Leishmania almeno una volta durante lo studio; per cui approssimativamente il 43% dei vaccinati ed il 28% dei controlli sono rimasti negativi durante l’intera fase dell’esposizione naturale;

• Follow-up della carica parassitaria: è stata comparata l’evoluzione della carica parassitaria tramite la rtPCR. Quando un cane è morto, l’ultimo valore di carica disponibile è stato riportato fino a M24:

  • È stato osservato un aumento della carica parassitaria media in entrambi i gruppi da M9 alla fine dello studio;
  • I valori medi sono risultati significativamente più alti nel gruppo controllo che in quello dei vaccinati in tutto il periodo;

• È stata osservata una maggiore probabilità di diventare infetti nei controlli che nei vaccinati (differenza significativa: p=0,0265);

• È stata osservata una maggiore probabilità di diventare sintomatici nei controlli che nei vaccinati (differenza significativa: p=0,0466). Le manifestazioni cliniche più gravi sono state osservate principalmente nel gruppo controllo, in cui l’evoluzione della malattia ha richiesto l’eutanasia di alcuni cani per ragioni etiche ed ha portato alla morte spontanea di un soggetto. Anche per un cane vaccinato è stata necessaria l’eutanasia;

• La percentuale dei cani dichiarati infetti alla fine dello studio (M24) è risultata significativamente differente tra i gruppi (superiore nei controlli: p=0,0254); stesso riscontro per la percentuale dei cani sintomatici;

• La percentuale dei cani dichiarati sintomatici alla fine dello studio (M24) è risultata significativamente più alta nei controlli che nei vaccinati (differenza significativa: p=0,0455);

• È stato osservato che i vaccinati che diventavano infetti e mostravano manifestazioni cliniche, non trovavano alcun giovamento dalla continuazione della vaccinazione.

Per completare queste analisi statistiche è stato usato il calcolo dell’odds-ratio (OD): è risultato significativamente > 1, ovvero i cani vaccinati hanno significativamente maggiore probabilità di bloccare l’infezione attiva rispetto ai controlli; precisamente il rischio (probabilità) per i cani vaccinati di sviluppare un’infezione attiva è risultato 3,6 volte più basso rispetto ai controlli. Anche il calcolo dell’OD in relazione ai casi sintomatici è risultato > 1: i cani vaccinati hanno una probabilità di manifestare la forma clinica di 3,8 volte inferiore rispetto ai controlli (1).

Odds-Ratio infezione attiva

Conclusioni

In definitiva questo rappresenta lo studio chiave della richiesta (della ditta) ed ha dimostrato il beneficio della vaccinazione, secondo lo schema raccomandato (3 somministrazioni come vaccinazione primaria ed 1 boost annuale) seguendo i cani per 24 mesi, nel ridurre il numero dei cani che sviluppano un’infezione attiva e la probabilità di sviluppare i segni clinici nei cani vaccinati. Ciò convalida lo schema vaccinale ed in particolare l’iniezione boost dopo 1 anno. È stato osservato che il contatto col parassita ad Ibiza è risultato basso (1 controllo ha sviluppato la forma sintomatica portando ad eutanasia e un vaccinato ha sviluppato la forma asintomatica). Conseguentemente non è possibile arrivare ad una conclusione chiara per quanto riguarda l’efficacia del vaccino a Ibiza, per via del contesto epidemiologico specifico dello studio di campo, per cui tale efficacia è risultata più difficile da valutare. Questo può essere collegato all’alto numero di animali richiesto per dimostrare il beneficio della vaccinazione nelle zone con bassa prevalenza (1).

Studio sull’efficacia clinica del vaccino CaniLeish® in aree endemiche

Si è trattato di uno studio aperto multicentrico eseguito per valutare l’efficacia del vaccino (110 microgr. di ESP), utilizzato secondo il protocollo della vaccinazione primaria (3 vaccinazioni a 3 settimane di distanza), in aree endemiche per leishmaniosi canina. Sono stati inclusi cani di varie razze, d’età da 5,5 mesi a 12 anni al D0, distribuiti in 23 località francesi e 12 italiane; i dati di 221 soggetti sono stati interpretati per l’analisi d’efficacia. Ad ogni vaccinazione i soggetti sono stati visitati per evidenziare eventuali effetti collaterali riconducibili alla vaccinazione. Analisi: all’inclusione analisi ematologiche e sierologiche e PCR su midollo; 2 settimane dopo l’ultima iniezione: IgG1 e IgG2 anti-ESP e -PSA vaccinali e IgG anti-Leishmania. I risultati sierologici sono stati valutati secondo due criteri: suddivisione dei soggetti per età (giovani di circa 6 mesi 26,7%, adulti 73,3%) e la sieropositività per Leishmania al D0 (90% negativi, 10% positivi) (1).

Effetti collaterali sono stati registrati nel 28% dei cani, e la maggior parte consistevano in reazioni nel sito d’iniezione (edemi, granulomi, dolore), in alcuni casi anche segni generali (letargia, ipertermia) o di natura allergica (edemi allergici, reazioni anafilattiche). L’analisi statistica dei dati sierologici non ha evidenziato differenze significative tra gruppi qualunque fosse lo stato per Leishmania (positivi o negativi). Inoltre successivamente un altro studio ha eseguito un’analisi esplorativa sui dati immunologici cumulativi degli studi d’efficacia del vaccino, stabilendo che la sierologia, qualunque fosse l’isotipo o l’antigene (ESP o PSA), non è risultata sufficientemente correlata con la protezione (1).

Studi di laboratorio

Questi studi sono intesi a valutare l’inizio e la durata dell’immunità.

Inizio dell’immunità (IdI)
Nel primo studio presentato sono stati inclusi Beagle di 6 mesi sieronegativi per Leishmania; metà ha ricevuto le 3 iniezioni di base (100 microgr. di ESP) e l’altra metà è stata utilizzata come controllo. Tre settimane dopo l’ultima iniezione (D63) è stato eseguito il DTH test per valutare la risposta T, e sono state eseguite le analisi (ematologiche e delle sottopopolazioni linfocitarie al D0, D14, D21, D42, D63 e D70), della risposta umorale (ELISA IgG1 e IgG2 anti-ESP e -PSA, IgG anti-Leishmania al D0, D21, D42, D56 e D70) e cellulare (CMLA al D0, D63 e D70). Tutti gli animali sono rimasti in buona salute ed hanno preso peso regolarmente ed i parametri ematologici sono rimasti entro i limiti normali senza differenze significative tra i due gruppi. Al D70 non c’è stata una chiara evidenza di alcun effetto dell’iniezione degli antigeni di Leishmania sul conteggio delle sottopopolazioni linfocitarie e dei parametri ematologici. Tre settimane dopo la vaccinazione primaria, il vaccino ha indotto una risposta mista Th1/Th2, evidenziata dalla prevalente risposta IgG2 anti-PSA, dalla risposta mista IgG1/IgG2 anti-ESP e dall’aumento della CMLA (testimone della capacità dei macrofagi di uccidere il parassita). È stata osservata anche la positività al DTH test nella maggior parte dei cani vaccinati (correlata in letteratura con la resistenza all’infezione).

È pacifico che la ditta richiedente ha condotto tutti i test immunologici più importanti in accordo con le attuali conoscenze e letteratura; tutti i dati hanno messo in evidenza la complessità della risposta del sistema immunitario all’infezione da Leishmania. Anche se sono stati indagati molti parametri, non è stato possibile definire alcuno specifico marker o profilo che si correlasse con la protezione o l’infezione, come stabilito dall’analisi esplorativa dei dati immunologici cumulativi (presentati nel prosieguo).

È particolarmente difficile definire l’IdI per via della lentezza dello stabilirsi (il CVMP parla di “installation“, NdW) dell’infezione, e quindi della malattia, dal momento dell’inoculazione iniziale all’inizio della patologia (periodo d’incubazione). A causa della mancanza di correlazione tra biomarker e protezione, l’IdI non può essere stabilito da questo studio. Comunque l’IdI può essere definito sulla base dello studio di campo chiave (3.1.1) come l’intervallo di tempo tra la terza iniezione e l’inizio della fase d’esposizione, cioè quando i cani sono stati trasferiti nei siti d’infestazione durante la stagione dei flebotomi a Napoli e Barcellona; visto che la differenza è di 22 e 27 giorni, la ditta richiedente ha proposto di fissare l’IdI a 4 settimane, che il CVMP ha ritenuto accettabile (1).

Nel secondo studio sono stati inclusi cani di 6 mesi (sieronegativi per ESP, PSA ed intero parassita) suddivisi in 10 vaccinati (vaccinazione di base con 100 microgr./ml di ESP + 60 microgr. QA-21) e 10 controlli. Nel follow-up sono stati valutati la temperatura rettale ed il peso; sono stati eseguiti prelievi di sangue per valutare la risposta immunitaria umorale (IgG1 e IgG2 anti-ESP e -PSA al D0, D21, D42 e D56 e l’IFAT per gli anticorpi anti-Leishmania al D0 e D56) e cellulare (CMLA al D0 e D62, test di linfoproliferazione ed il test IFN-ELISpot al D62). Tutti gli animali sono rimasti in buona salute ed hanno preso peso regolarmente e non sono state osservate reazioni generali né episodi di ipertermia dopo la vaccinazione. Tre settimane dopo la terza iniezione vaccinale, i linfociti T hanno acquisito la capacità di proliferare e di produrre IFN- in risposta all’antigene di Leishmania per promuovere la distruzione dei parassiti attraverso l’attivazione macrofagica. La fase vaccinale di questo studio ed il relativo follow-up di molti parametri immunologici ha dimostrato una risposta mista IgG1/IgG2 contro le proteine vaccinali (ESP) ed una predominante risposta IgG2 anti-PSA; tale risposta è correlata con l’immunità cellulare come mostrato dall’aumento della CMLA e dall’attivazione dei LT. Questi dati sono risultati comparabili ed omogenei a/con quelli dello studio d’efficacia precedente. Ma l’interpretazione dei risultati di questa fase dello studio è stata difficile perché non è stato stabilito il valore protettivo dei suddetti parametri.

Papatacci - insetti vettori della Leishmaniosi

Nella fase successiva, tre settimane dopo l’ultima vaccinazione (D63/W0), i cani hanno subito un’inoculazione endovenosa di uno stipite virulento di L. infantum (ITMAP-263 a 108 promastigoti per cane). Il follow-up dei successivi 20 mesi è stato volto a rilevare l’eventuale infezione (PCR e coltura midollari) ed i vari parametri immunologici ed ematobiochimici, ma non è stato possibile rilevare alcun segno clinico chiaramente riconducibile alla leishmaniosi e tra i gruppi dei vaccinati e dei controlli non è emersa alcuna differenza dei parametri ematobiochimici (follow-up clinico e paraclinico). L’inoculazione dello stipite virulento ha indotto un’infezione debole e tardiva dal momento che è stata rilevata (PCR e coltura) solo in 4 cani su 10 in ciascun gruppo, 9 mesi dopo la prova, che non è stata in grado di indurre la malattia con espressione clinica dell’infezione. La risposta immune contro le ESP indotta dalla vaccinazione primaria è diminuita o scomparsa, mentre l’immunità cellulare T è perdurata, ma l’infezione sperimentale non è stata sufficientemente virulenta da permettere di stabilire la protezione conferita dal vaccino. L’indagine è stata estesa oltre un anno in quanto la prima rilevazione dell’infezione si è verificata 9 mesi dopo l’inoculazione, ma nonostante questo lungo periodo, il tasso d’infezione è rimasto troppo basso per valutare l’efficacia del vaccino, e l’inoculazione sperimentale non si è rivelata sufficientemente virulenta da permettere di determinare l’IdI. Come riportato più volte in letteratura, è assai difficile stabilire un valido modello d’infezione/malattia sperimentale, infatti si trovano dati discordanti e sostanzialmente inconcludenti (metodi eterogenei e non riproducibili); questo può essere dovuto all’impossibilità di replicare in laboratorio le condizioni naturali di campo e l’enorme variabilità dell’esposizione dei cani ai flebotomi (infetti e non infetti). Comunque per ragioni etiche e perché erano già disponibili i dati dello studio di campo (lo studio chiave), la ditta richiedente ha deciso non ripetere la prova sperimentale.

Tuttavia è stato osservato che anche nel gruppo dei vaccinati alcuni cani sono risultati infetti ed hanno sviluppato un’infezione persistente; la vaccinazione di questi cani non ne ha permesso la protezione contro l’infezione, anche se la risposta immunitaria di questi soggetti dopo la vaccinazione è risultata simile a quella dei cani protetti. Inoltre è stato osservato che i cani infetti persistentemente, sia controlli che vaccinati, presentano IgG2 anti-ESP dopo l’inoculazione sperimentale, al contrario dei cani resistenti, mentre il postulato di partenza era che le IgG2 rappresentano i parametri della risposta immunologica protettiva Th1. Anche se ci sono alcune indicazioni per un trend, da questo studio non è stato possibile trarre conclusioni chiare sulla possibile correlazione tra la risposta immunologica e l’evoluzione dell’infezione (1).


Durata dell’immunità (DdI)

In un primo studio sono stati inclusi Beagle sieronegativi di 5-7 mesi, equamente divisi tra vaccinati (100 microgr./ml di ESP, vaccinazione primaria) e controlli e seguiti da W0 a W61 per quanto riguarda il peso, i parametri ematologici, l’immunità umorale (ELISA IgG1/IgG2 anti-ESP e -PSA e IFAT IgG anti-Leishmania) e cellulare (sottopopolazioni di LT e CMLA). Tutti gli animali sono rimasti in buona salute ed hanno preso peso regolarmente ed i parametri ematologici sono rimasti normali senza differenza tra i due gruppi. Un anno dopo l’ultima iniezione (W58) è stato eseguito un DTH test su ogni animale di ciascun gruppo, per valutare la risposta immunologica cellulomediata T specifica: i cani di entrambi i gruppi hanno mostrato reazioni locali dopo l’iniezione degli antigeni di Leishmania, con una risposta DTH che è comparsa prima ed è risultata significativamente più intensa nei vaccinati che nei controlli (segno di un’immunità cellulare specifica contro gli antigeni di Leishmania nei vaccinati). L’osservazione di un boost della risposta umorale nei cani vaccinati ha indicato la presenza di una memoria immunologica generata dalla vaccinazione primaria: tre settimane dopo l’iniezione di leishmanina (W61) il 70% dei vaccinati ha presentato di nuovo titoli IgG1 anti-ESP, il 90% IgG2 anti-ESP, il 50% IgG2 anti-PSA ed il 90% IgG anti-Leishmania, mentre nessun boost di IgG1 anti-PSA. Il vaccino ha indotto un IdI umorale e cellulare 3 settimane dopo la vaccinazione, definito dalla risposta anticorpale mista IgG1/IgG2 anti-ESP ed IgG2 anti-PSA che sono durate meno di 6 mesi, e da un aumento della CMLA che è continuata per 1 anno. Il DTH test eseguito un anno dopo la vaccinazione primaria ha dimostrato la presenza di una risposta immune cellulomediata di memoria testimoniata dalla positività al test e dal boost della risposta umorale.

Il CVMP conclude che questo studio ha rilevato l’assenza della persistenza degli anticorpi dopo la vaccinazione, qualsiasi fosse la loro natura, ed un effetto boost in seguito al contatto con l’antigene di Leishmania; mentre è stata osservata una risposta cellulare persistente. Nell’interpretazione di questo studio sorgono problemi interpretativi per via del valore dei parametri indagati e la loro potenziale correlazione con l’efficacia della vaccinazione: i risultati hanno confermato la presenza di un’immunità di memoria rivelata dal DTH test nella maggior parte dei cani, ma da questo studio non può essere fatta alcuna affermazione sulla DdI (1).

In un secondo studio sono stati utilizzati Beagle di 6 mesi come nel precedente (suddivisione in gruppi e protocollo vaccinale). Il follow-up è stato analogo al precedente ed è durato 12 mesi dalla vaccinazione primaria. Un anno dopo l’ultima iniezione vaccinale (nuovaW0) è stata eseguita un’infezione sperimentale endovenosa con un ceppo virulento di L. infantum. Dopo 47 settimane è iniziata e si è sviluppata l’infezione (rtPCR e coltura midollari) ed il follow-up ha previsto diverse valutazioni a cadenza settimanale dei parametri clinici ed ematobiochimici, dell’immunità umorale (solite IgG1 e IgG2 contro gli antigeni vaccinali e IgG anti-Leishmania), cellulomediata (CMLA, IFN-ELISpot) ed il monitoraggio del sistema antiossidante del glutatione (GSH). Tra i due gruppi non è stata rilevata differenza dei parametri ematologici, mentre per quanto riguarda la CMLA è leggermente aumentata nei controlli a W32 così come il valore medio nei vaccinati in seguito al challenge (l’infezione sperimentale) ed è rimasta significativamente più alta che nei controlli. La produzione media di IFN- è aumentata a W32 dopo il challenge in entrambi i gruppi, ma di più nei vaccinati (non significativamente a W32, significativamente a W47). Nella maggior parte dei controlli è stato registrato uno squilibrio della GSH reduttasi, mentre il rapporto nei vaccinati è rimasto stabile per tutta la durata dello studio.

Per lo stato d’infezione e l’immunità umorale riportiamo la tabella come sul documento del CVMP:

EMA: EMA/CVMP/296057/2010 - EPAR - Public assessment report, CaniLeish Scientific discussion (April 2011)

Le conclusioni del CVMP sono che nonostante la diminuzione dei cani che sviluppano l’infezione persistente nel gruppo dei vaccinati (30% contro il 70% nel gruppo controllo), questo studio non permette di trarre conclusioni sull’efficacia del vaccino né sulla DdI, in quanto l’analisi statistica non permette di stabilire differenze statisticamente significative tra di due gruppi, probabilmente a causa del numero (esiguo?, NdW) degli animali inseriti nello studio. Comunque la DdI è sostenuta anche dallo studio di campo che ha dimostrato il beneficio della vaccinazione secondo lo schema vaccinale raccomandato (3 somministrazioni come vaccinazione primaria ed 1 booster annuale). Il challenge non ha indotto una malattia clinica e la prima infezione è stata identificata 15 settimane dopo (sia nei controlli che nei vaccinati). Tuttavia è stato osservato che nel gruppo dei vaccinati c’è stato un più alto numero di cani che ha controllato l’infezione (infezione mai rilevata) o l’hanno bloccata (infezione rilevata ma progressivamente bloccata) durante le 47 settimane di follow-up dopo il challenge. Comunque questo challenge è risultato più efficace nell’indurre l’infezione, di quello dello studio sull’IdI.

Considerando la carica parassitaria a livello individuale (comparazione dei dati dei cani infetti, vaccinati o controlli), la vaccinazione non ha permesso di diminuire la carica nei cani vaccinati infetti in comparazione con i controlli. L’analisi dei dati individuali ha mostrato che l’utilizzo dei parametri sierologici o dell’immunità cellulare per descrivere e predire lo stato futuro del cane nei confronti dell’infezione non è chiaro ed evidente (1).

Una sieroconversione di entrambi le risposte umorali (IgG anti-Leishmania ed IgG2 anti-ESP) è stata osservata solo nei controlli infetti permanentemente, e quindi questa sieroconversione è stata correlata con l’infezione in questi cani. Al contrario i controlli che hanno bloccato l’infezione non hanno sieroconvertito.

Secondo il CVMP questi risultati sottolineano ancora le difficoltà di definire un profilo protettivo immunologico post-infezione. Per diagnosticare l’infezione sono state usate la PCR e la coltura su midollo osseo ed è stata osservata una buona correlazione tra i risultati di queste due indagini: a W47, il 20% dei controlli ed il 70% dei vaccinati è risultato non infetto, mentre l’80% dei controlli ed il 30% dei vaccinati ha presentato un’infezione asintomatica.

Nell’insieme questo studio, anche se non definitivamente conclusivo (a causa della mancanza della significatività statistica), ha confermato un effetto benefico del vaccino 1 anno dopo l’infezione per ridurre lo sviluppo di un’infezione persistente durante le 47 settimane seguite al challenge, e supporta i dati ottenuti nello studio di campo. Conseguentemente una DdI di 1 anno dopo la ri-vaccinazione è stata accettata dal CVMP (1).

Conclusione generale sugli studi di laboratorio

Dopo la vaccinazione è stata osservata una risposta costante ed omogenea negli studi di laboratorio per i seguenti parametri:

Risposta umorale: risposta mista IgG1/IgG2 anti-ESP e predominante IgG2 anti-PSA; questa risposta umorale non è persistita nel tempo ma ha subito un boost in seguito ad un nuovo contatto con l’antigene un anno dopo la vaccinazione primaria; 
Risposta cellulare: in tutti i cani vaccinati è stata osservata una risposta omogenea e persistente, sulla base dei test della linfoproliferazione, della CMLA e del DTH. 
Sono stati eseguiti due challenge (tentativi d’infezione sperimentale per via endovenosa): il primo (per stabilire l’inizio dell’immunità), eseguito 3 settimane dopo la vaccinazione, ha indotto un’infezione debole e tardiva sia nei controlli che nei vaccinati, e lo studio non ha permesso di arrivare ad alcuna conclusione sull’efficacia del vaccino; il secondo challenge (per stabilire la durata dell’immunità), eseguito un anno dopo la vaccinazione, ha dimostrato una riduzione del numero degli animali infetti nel gruppo dei vaccinati. I dati di laboratorio sono stati considerati solamente come supporto per avvalorare le conclusioni dello studio di campo (1).

Studi generali

La ditta richiedente ha condotto un’analisi dei dati cumulativi degli studi d’efficacia per determinare se il profilo immunologico indotto dalla vaccinazione si correla con la protezione o la resistenza alla malattia. Ma il CVMP ribadisce che questi dati sono insufficienti per validare qualsiasi biomarker (1).

È stato eseguito un altro studio per valutare possibili interferenze tra gli anticorpi indotti dalla vaccinazione e metodi diagnostici diversi: sono stati utilizzati cani di 5-6 mesi divisi in due gruppi; a 10 è stata fatta la vaccinazione primaria e 2 sono stati lasciati come controlli. I soggetti sono stati seguiti clinicamente e ne è stata valutata la risposta immunologica (i due isotipi di IgG contro le proteine vaccinali) e sono stati eseguiti dei test diagnostici comuni: tre diversi metodi IFAT (che utilizzano isolati di Leishmania sia omologhi che eterologhi rispetto al vaccino) e tre diversi test rapidi commerciali (che utilizzano antigeni di Leishmania purificati). Non sono stati notati effetti collaterali legati al vaccino e tutti gli animali sono rimasti in buona salute. Prima dell’inizio della vaccinazione tutti i soggetti sono risultati sieronegativi sia per gli isotipi contro le proteine vaccinali (ESP e PSA) sia per le IgG anti-Leishmania, ed i controlli lo sono rimasti per tutto lo studio. Dopo la vaccinazione, tutti i cani hanno presentato una buona risposta immunologica nei confronti del vaccino: i tassi di sieroconversione per le IgG1 e IgG2 anti-ESP e -PSA sono risultati in conformità ai dati ottenuti negli studi precedenti. La risposta umorale anti-Leishmania infantum valutata con i tre metodi IFAT è stata diversa in base all’isolato di Leishmania utilizzato: due settimane dopo la terza iniezione vaccinale (D56) il 100% dei cani ha risposto nei confronti dell’isolato omologo utilizzato nei laboratori Virbac™ ed anche nei confronti di un isolato eterologo (questa risposta è diminuita rapidamente, e 4 mesi dopo la terza iniezione vaccinale i titoli sono risultati bassi); il 70% dei cani ha risposto nei confronti di un altro isolato eterologo (anche questi anticorpi sono diminuiti rapidamente e solo il 30% degli animali è rimasto positivo 2 mesi dopo la terza iniezione vaccinale). Invece tutti e tre i test rapidi hanno dato esito negativo dopo la vaccinazione e fino alla fine dello studio. Dunque questo studio ha dimostrato che la risposta umorale (anticorpi IgG) diretta contro parassiti interi di L. infantum in seguito alla vaccinazione, interferisce con i test IFA eseguiti in laboratori di referenza che utilizzano isolati di L. infantum sia omologhi che eterologhi, mentre non interferisce con alcuni test rapidi ambulatoriali, che quindi, secondo quanto riportato dal CVMP, possono essere utilizzati per distinguere gli anticorpi vaccinali da quelli indotti dall’infezione naturale (1).

Conclusioni generali sull’efficacia

Gli studi presentati nel dossier hanno confermato la difficoltà di valutare l’efficacia di un vaccino contro una malattia parassitaria caratterizzata da un’evoluzione e da manifestazioni eterogenee. La dimostrazione dell’efficacia del vaccino è stata basata su uno studio di campo della durata di due anni, che ha coinvolto cani vaccinati e controlli, esposti naturalmente all’infezione in zone ad alta endemia. Dopo questi due anni, il vaccino ha dimostrato di ridurre il numero dei cani che sviluppano un’infezione attiva nel gruppo dei vaccinati e, dal punto di vista del singolo cane, di ridurre significativamente la probabilità di infettarsi e di sviluppare la malattia. In condizioni di debole pressione infettiva, non è stato possibile individuare un beneficio chiaro derivante dalla vaccinazione.

Gli studi di laboratorio hanno fornito informazioni limitate, nonostante l’esecuzione di molte indagini biologiche come la valutazione dell’immunità umorale (IgG1 e IgG2 contro gli antigeni vaccinali e IgG totali) e cellulare: non è stato possibile definire in maniera netta alcun biomarker o profilo immunologico che fosse associato alla protezione dall’infezione. Tuttavia i dati delle prove sperimentali hanno mostrato che l’infezione può essere rilevata da 4 a 9 mesi dopo l’infezione sperimentale e che la vaccinazione determina una risposta costante ed omogenea. Comunque tale risposta non può essere collegata in maniera chiara alla protezione e alla risposta futura dei cani all’infezione.

Considerando la diversità dell’evoluzione dell’infezione ed il periodo d’incubazione variabile (che può essere anche di diversi mesi), è risultato difficile definire per questo vaccino i tempi quali l’inizio e la durata dell’immunità e della protezione negli studi di laboratorio, ma una durata dell’immunità di un anno dopo l’ultima ri-vaccinazione ed un inizio dell’immunità di 4 settimane, sono stati supportati dai dati di campo (1).

Valutazione beneficio / rischio

La valutazione del dossier presentato dalla ditta richiedente ha tenuto conto che questo vaccino è destinato ad un mercato limitato, e sono state implementate alcune riduzioni nei dati normalmente richiesti dal CVMP per l’autorizzazione dei vaccini secondo le linee guida sui dati richiesti per i prodotti veterinari immunologici per usi e specie minori (5).

CaniLeish® è il primo vaccino ad essere autorizzato per la profilassi contro l’infezione da Leishmania infantum in Europa. In considerazione della diffusione dell’infezione, della sua natura zoonotica e della difficoltà della terapia, benché i risultati sull’efficacia non abbiano mostrato la protezione completa dei cani vaccinati, si può concludere che la vaccinazione contro la leishmaniosi possa rappresentare un’alternativa valida e/o complementare ai mezzi che già sono a disposizione (terapeutici e profilattici). Anche se la protezione completa contro la leishmaniosi o l’eradicazione della malattia non sono possibili, questo vaccino è in grado di ridurre il rischio di sviluppare l’infezione attiva e la malattia a livello individuale, e di concorrere a diminuire l’incidenza della malattia al livello della popolazione canina. Inoltre, benché l’impatto epidemiologico globale non possa essere stimato dai dati del dossier, ci si può aspettare che, in relazione alla leishmaniosi, il miglioramento della situazione nel cane potrà avere un impatto positivo anche sulla salute umana. Infine nessun rischio grave è stato associato alla vaccinazione, neanche nei cani già infetti.

Secondo il CVMP il rapporto beneficio/rischio è a favore del primo e quindi del vaccino e quindi della concessione dell’autorizzazione.


Filmato del prof. Gaetano Oliva sul vaccino:

Bibliografia

1. EMA: EMA/CVMP/296057/2010 -- EPAR -- Public assessment report, CaniLeish Scientific discussion [PDF - April 2011];

2. Merlen T, Sereno D, Brajon N, Rostand F, Lemesre JL -- Leishmania spp: completely defined medium without serum and macromolecules (CDM/LP) for the continuous in vitro cultivation of infective promastigote forms -- Am J Trop Med Hyg. 1999;60(1):41-50 [abstract - PDF];

3. Papierok GM, Vicens S, Lemesre JL -- United States Patent application publication US 2006/0140955 A1 -- Jun. 29, 2006 [PDF];

4. Oliva G, Scalone A, Foglia Manzillo V, Gramiccia M, Pagano A, Di Muccio T, Gradoni L -- Incidence and time course of Leishmania infantum infections examined by parasitological, serologic, and nested-PCR techniques in a cohort of naive dogs exposed to three consecutive transmission seasons -- J Clin Microbiol. 2006;44(4):1318-22 [abstract - HTML (1 o 2) - PDF (1 o 2)];

5. EMA: EMA/CVMP/IWP/123243/2006-Rev.2 -- Guideline on Data requirements for Immunological veterinary medicinal products intended for minor use or minor species/limited markets [PDF - April 2011].

* Per saperne di più sul vaccino e sulla leishmaniosi
consigliamo di consultare il sito web:

www.leishmania.it

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