Dosaggio di FOS prebiotici

a cura di Claudio Corradini
Istituto di Cromatografia C.N.R. Area Ricerca Roma
Relazione tratta dal Convegno "Il buono nei cibi", Morgan Ed. Tecniche, giugno 2001

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Il controllo di qualità del dato analitico nell'analisi degli alimenti è di primaria importanza per valutare in modo rigoroso, sia qualitativamente che quantitativamente, sostanze accreditate di proprietà benefiche naturalmente presenti negli alimenti o aggiunte come ingredienti specifici per alimenti funzionali o come componenti di integratori alimentari. L'obiettivo della presente comunicazione è quello di fornire indicazioni in relazione a metodi di analisi cromatografica ad alta risoluzione particolarmente specifici e selettivi per la determinazione e caratterizzazione di fruttooligosaccaridi (FOS) e fruttani.
Come ingredienti alimentari FOS e fruttani possono essere indicati come "fibra alimentare". Con il termine generico di fibra alimentare o "fibra dietetica" (FD) si definisce una frazione degli alimenti priva di interesse nutrizionale, non classificabile dal punto di vista chimico in modo omogeneo. Strutturalmente le FD sono composte da carboidrati, non a base di amido o carboidrati ossidati componenti le pareti delle cellule, il parenchima o alcune secrezioni dei tessuti vegetali e la lignina, che risultano resistenti alla digestione da parte degli enzimi dell'intestino tenue dell'uomo.
Le fibre dietetiche possono essere suddivise in solubili ed insolubili. Le fibre solubili vengono fermentate estensivamente e sono metabolizzate per produrre idrogeno, metano, biossido di carbonio e acidi grassi a catena corta (SCFA). Anche il grado di fermentazione dipende dalla struttura chimica della fibra. Sono ben documentati due effetti diretti di questa fermentazione: una diminuzione del pH intraluminale e una proliferazione delle cellule epiteliali dell'intestino cieco e del colon. Viceversa, le FD insolubili - non viscose- non fermentabili possono abbreviare il transito intestinale e aumentare la massa fecale, ma non causare cambiamenti significativi nel metabolismo dei carboidrati o dei lipidi, o modificare il pH intraluminale. Le fibre insolubili che non vengono, o vengono solo marginalmente fermentate, esercitano soprattutto un effetto di "accumulo" che riduce il tempo di transito e aumenta la massa fecale. Le FD non vengono digerite ma possono influenzare la digestione, definita come idrolitica, e altri processi che hanno luogo nell'intestino tenue e che vengono seguiti dall'assorbimento dei prodotti di digestione attraverso la mucosa dell'intestino tenue. L'effetto più importante è sull'idrolisi dell'amido e sull'assorbimento dei carboidrati, che porta ad una risposta glicemica ridotta e appiattita, così come ad una ridotta insulinemia. Parte delle funzioni sopra esposte possono essere assolte da fibre alimentari solubili quali i fruttooligosaccaridi (FOS) o fruttani, presenti in un integratore alimentare od opportunamente aggiunti come ingrediente di un determinato alimento.
L'assunzione di fruttani (i quali non vengono idrolizzati nel tratto digestivo, non sono assorbiti dalla mucosa intestinale e transitano intatti nel colon), determina un incremento nella produzione dei bifidobatteri, di acidi carbossilici, in particolare di acido lattico, con conseguente decremento del valore di pH che rafforza l'effetto barriera della flora intestinale in grado di inibire la crescita di batteri potenzialmente patogeni, quali Clostridium ed Escherichia coli. Inoltre, una diminuzione del pH favorisce un miglior assorbimento del calcio in quanto i suoi sali risultano maggiormente solubili.
FOS ed inulina possono essere considerati alimenti prebiotici e rappresentano una fonte preferenziale di carbonio per batteri utili, quali i bifidobatteri e lattobacilli, ma non per batteri putrefattivi come colibacilli e clostridi. La regolare assunzione di fruttani nella dieta aiuta a ristabilire la normale flora intestinale dopo terapia antibiotica, ha effetto nell'alleviare le costipazioni intestinali e sopprimere le fermentazioni putrefattive.
. Ingredienti alimentari (o integratori alimentari) con caratteristiche prebiotiche possono svolgere un'azione regolatrice sulla microflora intestinale più selettiva e con maggiori probabilità di successo di quelli probiotici, considerato che questi ultimi per raggiungere il colon intatti e vitali debbono attraversare gran parte del tratto digerente, superando varie barriere di natura fisica e chimica. Inoltre i fruttani aggiunti come ingredienti negli alimenti favoriscono la biosintesi di prodotti utili, quali vitamine del gruppo B e acido folico, attivano il sistema immunitario, presentano una azione ipocolesterolemizzante e riducono la presenza di metaboliti tossici. Non ultimo i fruttani presentano un blando carattere edulcorante associato ad un ridotto apporto calorico (2 kcal/g) e spiccata azione ipoglicemizzante, rendendo questo tipo di ingrediente particolarmente indicato nella formulazione di integratori o alimenti dietetici particolarmente idonei per soggetti affetti da diabete. Nel riquadro sono riportati in sintesi gli effetti funzionali dei fruttooligosaccaridi ed inulina.
I fruttani sono carboidrati costituiti da miscele di oligo- e polisaccarididel fruttosio con struttura chimica GFn [G = glucosio, F = fruttosio ed n = numero dei monomeri di fruttosio collegati tra loro mediante legami glicosidici b(1Æ2)], con struttura simile a quella schematizzata in figura 1. Si definiscono più propriamente fruttooligosaccaridi (FOS) i derivati del fruttosio con grado di polimerizzazione (DP) compreso tra 3 e 10, fruttani quelli con valori di DP più elevati.
I fruttani sono carboidrati di riserva accumulati negli organi vegetativi di varie specie di piante tra le quali il tupinambur, la cicoria, le graminacee da granella e le foraggere dei climi temperati-freddi con fotosintesi a C3. Questi carboidrati sono inoltre componenti naturali di molti alimenti, quali ad esempio carciofi, porri, cipolle, aglio, banane, frumento, ecc. Discordi sono i dati relativi alla dose giornaliera raccomandata in riferimento a FOS e fruttani. I dati reperibili in letteratura differiscono in relazione alle polazioni ed alle abitudini alimentari. Un valore medio si attesta nell'ordine dei 3-6 grammi/di e con la dieta corrente e comunque possono essere assunti anche valori superiori. Ad esempio, per integratori dietetici, reperibili in commercio, costituiti da bustine contenenti g 5 di fruttani, la posologia consigliata è di 2-3 bustine al giorno (10-15 g/die). I fruttani reperibili in commercio sono generalmente costituiti da inulina. L'inulina è una miscela polidispersa di catene lineari di fruttani ed è ricavata industrialmente dalle radici di cicoria mediante estrazione con acquabollente, seguita da raffinazione ed essiccazione mediante tecnica spry-dry. Il grado di polimerizzazione dell'inulina da cicoria varia da 3 a 60 unità monomeriche. Sono inoltre disponibili fruttani da inulina dalla quale è stata rimossa la frazione a più basso grado di polimerizzazione (degree of polymerization, DP), avente un DP medio di circa 25. L'oligofruttosio (FOS) è ottenuto mediante idrolisi parziale con l'enzima fruttossidasi (inulinasi) ed è composto da catene lineari GFn con n compreso tra 2 e 8 (valore medio 4).
Inoltre, sono reperibili in commercio FOS ottenuti a partire dal saccarosio per azione dell'enzima fruttofuranosidasi prodotto da Aspergillus niger. I FOS così formati contengono, oltre al saccarosio, GF2 (1-kestosio), GF3 (nistosio) e GF4 (fruttosil-nistosio) in varie proporzioni.
L'impiego dei fruttani come integratori dietetici e ingredienti non nutrizionali aggiunti in alimenti funzionalizzati risale al 1984, quando in Giappone vennero inizialmente impiegati nella realizzazione di "alimenti funzionali", cioè alimenti ai quali è riconosciuta un'azione benefica in virtù del loro contenuto in sostanze regolatrici di alcune funzioni vitali. Attualmente i fruttani sono impiegati come integratori alimentari prebiotici o quali ingredienti funzionali in alimenti fortificati, ad esempio in integratori alimentari od alimenti simbiotici (contemporanea presenza di pre- e probiotici). Assumere probiotici contemporaneamente ai prebiotici in prodotti dietetici specifici consente di fornire, oltre ai batteri indispensabili per un corretto equilibrio della flora batterica, uno specifico substrato nutritivo privilegiato dei batteri eubiotici, aumentando di fatto la loro sopravvivenza.
FOS ed inulina spesso, nell'etichettatura dei prodotti alimentari che li contengono, sono genericamente indicati come fibre alimentari. Da quanto sopra esposto è evidente l'importanza di disporre di metodi analitici specifici in grado di caratterizzare questa classe di carboidrati di interesse alimentare.
La cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC) è uno dei metodi più diffusi per la separazione, identificazione e dosaggio dei carboidrati negli alimenti.
Per superare le difficoltà intrinseche di tale ampia classe di composti, sono state proposte diverse tecniche HPLC, che implicano l'impiego di colonne cromatografiche in cui l'eluizione selettiva degli analiti è in relazione a diversi meccanismi ritentivi. Numerose reviewe e testi scientifici specifici sono stati pubblicati su tale vasto argomento.

Separazioni HPLC di carboidrati
Prima di illustrare nei dettagli i metodi cromatografici proposti per la caratterizzazione di fruttooligosaccaridi ed inulina di maggiore impiego in campo alimentare e della loro presenza in alcuni alimenti funzionali ed integratori alimentari, diamo una breve rassegna dei metodi più diffusi nel campo delle separazioni HPLC di carboidrati di interesse in campo alimentare. Le metodiche HPLC di maggiore diffusione in questo campo sono quelle realizzate utilizzando colonne impaccate con silice funzionalizzata con gruppi amminici (cromatografia ad interazione idrofilica - hydrophilic interaction chromatography - acronimo, HILIC), o scambiatori cationici in forma protonata o saturati con metalli.
Tra le colonne specificatamente proposte per analizzare carboidrati mediante HILIC, quelle più in uso sono ottenute funzionalizzando silice microparticellare, diametro 5 o 10 mm, con gruppi amminopropilici. Queste fasi stazionarie sono ampiamente utilizzate per la separazione e il dosaggio di carboidrati, sebbene la loro stabilità nel tempo possa essere compromessa dalla formazione di glicosilammine a causa dell'interazione di zuccheri riducenti presenti negli analiti con i gruppi amminici chimicamente legati alla fase stazionaria. Questo tipo di inconveniente può essere ovviato funzionalizzando la silice con gruppi polari quali ciano, diolo o ammidici, ovvero avvalendosi di colonne cromatografiche di sola silice. La scelta della fase mobile è subordinata al tipo di fase stazionaria impiegata, usualmente con colonne di amminopropil-silice si utilizzano miscele di acqua-acetonitrile, in cui la percentuale di acqua in acetonitrile varia dal 10 al 20%, nel caso si vogliono separare monosaccaridi o disaccaridi. Percentuali di acqua superiori a tali valori sono necessarie per ottenere l'eluizione di oligosaccaridi a più alto peso molecolare. Un incremento della percentuale di acqua nella fase mobile determina una perdita di selettività nei confronti dei monosaccaridi che risultano, a queste condizioni, meno ritenuti e, conseguentemente eluiti non risolti, con tempi di ritenzione prossimi a quello del volume morto.
L'utilizzo dell'acetonitrile come componente organico della fase mobile incontra tutti i requisiti necessari all'eluizione selettiva dei carboidrati, in relazione alla sua viscosità, ma soprattutto in termini di polarità e forza eluotropa del solvente. Più raramente sono impiegati altri solventi quali etile acetato o metanolo. Le separazioni di carboidrati mediante metodi cromatografici a scambio ionico sono generalmente realizzate impiegando fasi stazionarie a base polimerica.
Usualmente sono impiegate resine a scambio cationico in forma protonata o saturate con uno ione metallico, in cui diversi sono i meccanismi di ritenzione che possono essere coinvolti nel processo separativo. Tra quelli di maggiore interesse ricordiamo lo scambio ionico, l'esclusione ionica e l'esclusione sterica, lo scambio di legante, oltre a possibili interazioni con il supporto cromatografico (ad esempio interazioni di tipo idrofobico).
La ritenzione selettiva di zuccheri ed alditoli può essere opportunamente modulata saturando la colonna cromatografica con determinati ioni metallici. La colonna cromatografica impaccata con la medesima fase stazionaria a scambio cationico presenta una diversa ritenzione dei carboidrati eluiti, in relazione al metallo utilizzato per saturare la resina polimerica funzionalizzata con i gruppi solfonici. La formazione di legami cineticamente labili tra carboidrato e metallo è correlata alla possibile coordinazione dei gruppi idrossilici di zuccheri ed alditoli con determinati ioni metallici ed è stato osservato come la loro stabilità dipenda dalla stereochimica del carboidrato. Le separazioni sono normalmente ottenute impiegando acqua come fase mobile, termostatando la colonna cromatografica a temperature decisamente superiori alla temperatura ambiente. Ciò è reso necessario in quanto a temperatura ambiente si riscontra, per ogni carboidrato risolto, l'eluizione di due picchi corrispondenti alle forme anomeriche a e b, che presentano una diversa interazione con il metallo e conseguentemente un diverso tempo di ritenzione. Un incremento della temperatura della colonna cromatografica provoca un aumento della cinetica di interconversione delle due forme anomeriche, con conseguente coeluizione, per ogni carboidrato risolto, delle due forme anomeriche.
L'ordine di eluizione è comunque governato da due distinti effetti: - un effetto attribuibile allo scambio di legante, per mezzo del quale è possibile avere variazioni di selettività nei confronti dei carboidrati in funzione del metallo legato alla fase stazionaria; - un effetto di esclusione sterica che determina la scarsa ritenzione dei carboidrati a più alto peso molecolare e conseguente inefficacia di tali sistemi cromatografici nel separare gli oligosaccaridi. Quest'ultimo effetto rende questo sistema cromatografico praticamente inutilizzabile per la caratterizzazione di fruttooligosaccaridi e fruttani. Infine, ricordiamo che un elemento determinante nella definizione dell'efficacia dei metodi HPLC applicati alla soluzione di problemi separativi di carboidrati è rappresentato dal mezzo di rivelazione degli analiti eluiti. I carboidrati sono composti privi di gruppi cromofori o fluorofori. I metodi separativi sopra esposti sono usualmente eseguiti utilizzando come rivelatore l'indice di rifrazione. La rivelazione ad indice di rifrazione (IR) è in ordine di impiego il terzo possibile metodo di rivelazione in HPLC, dopo l'assorbimento UV/visibile e la rivelazione a fluorescenza. La rivelazione IR è impiegata in HPLC per tutte quelle sostanze che non presentano un sufficiente assorbimento di onde elettromagnetiche nel campo UV-visibile ed è, a tutt'oggi, quello più largamente in uso per la rivelazione dei carboidrati. La rivelazione IR, pur avendo raggiunto con la più recente strumentazione una capacità di rivelazione inferiore ai 25 ng, presenta alcuni limiti, quali la scarsa selettività e l'impossibilità di poter impiegare programmi di eluizioni in gradiente, che di fatto rende inutilizzabile anche la tecnica cromatografica HPLC per la simultanea determinazione di campioni in cui sono presenti mono-, oligo- e polisaccaridi.

HPAEC-PAD
I metodi di rivelazione ottica tradizionalmente impiegati in HPLC possono essere utilmente sostituiti, in determinati e specifici sistemi cromatografici per carboidrati, dalla rivelazione amperometrica pulsata (PAD).
Con questa tecnica di rivelazione i gruppi aldeidici ed alcolici dei carboidrati sono rivelabili, con un alto grado di sensibilità, misurando la corrente risultante dalla loro ossidazione su un elettrodo in oro al quale è applicato un determinato potenziale. Il responso anodico dei carboidrati è elettrocatalitico, con la diretta partecipazione della superficie dell'elettrodo nel meccanismo di ossidazione degli analiti. Il potenziale applicato all'elettrodo è ripetutamente pulsato tra tre diversi valori, al fine di evitare che i prodotti delle reazioni di ossidazione avvelenino la superficie dell'elettrodo, con conseguente inibizione di ulteriori ossidazioni.
In particolare, l'applicazione di un'opportuna combinazione dei potenziali applicati all'elettrodo di misura consente di mantenere la superficie dell'elettrodo attiva e stabile, in grado di eseguire la rivelazione selettiva ed altamente sensibile di una vasta gamma di carboidrati. In figura 2 è riportato uno schema relativo ai potenziali applicati all'elettrodo di misura in oro. E1 è il potenziale, applicato per il tempo t1, in cui si ha l'ossidazione degli analiti. Il potenziale dell'elettrodo è quindi variato al valore E2, con E2 >>
E1, mantenuto a questo valore per il tempo t2 e successivamente portato al valore E3, con E3 >> E2, per un tempo t3, al fine di rimuovere i prodotti di ossidazione e successivamente ridurre la superficie dell'elettrodo ad oro metallico, riportandolo cosi alle condizioni iniziali. L'integrazione della misura della corrente risultante dall'ossidazione dei carboidrati sulla superficie dell'elettrodo avviene nell'intervallo di tempo B-C. L'intervallo di tempo A-B permette il decadimento della corrente di carica dell'elettrodo nel passaggio del potenziale dal valore E3 alle condizioni iniziali E1. La frequenza delle variazioni di potenziale applicato all'elettrodo verrà cosi dedotta:

f = t1 + t2 + t3

I valori dei potenziali E1, E2, E3 applicati all'elettrodo di misura sono ottimizzati in funzione dei carboidrati che debbono essere rivelati (13). I carboidrati vengono rivelati in amperometria pulsata ad elevati valori di pH. Tale condizione operativa, considerato che i valori di pka dei carboidrati sono compresi nell'intervallo 12-14, consente di separare questi analiti come anioni, impiegando specifiche colonne cromatografiche a scambio anionico forte ed eluendo con una fase mobile fortemente basica. L'impiego di un sistema cromatografico a scambio anionico ad alto valore di pH, in congiunzione con un rivelatore amperometrico pulsato, permette di separare in modo selettivo ed altamente sensibile, miscele anche complesse di carboidrati sia di interesse biologico, sia in matrici agro-alimentari.
Questa tecnica cromatografica consente una discriminazione più selettiva della semplice selezione tra gruppi acidi e neutri, in quanto il processo ritentivo è influenzato dal grado di acidità di ogni singolo gruppo ossidrilico dei carboidrati. Ad esempio è possibile spiegare la separazione dei tre esosi galattosio, mannosio e glucosio, nonostante l'identicità delle loro dimensioni molecolari e numero dei gruppi ossidrilici, in funzione dei valori di pka di questi monosaccaridi (12.39 galattosio, 12.35 glucosio e 12.08 mannosio) e delle variazioni di acidità dei diversi gruppi ossidrilici in funzione della posizione assiale od equatoriale che questi assumono nelle forme piranosiche. Analogamente, la ridotta ritenzione degli alditoli in confronto ai corrispondenti zuccheri riducenti può essere spiegata in base alla loro acidità. Considerato che il gruppo ossidrilico anomerico è quello con un più spiccato carattere acido in confronto agli altri gruppi ossidrilici presenti, la sostituzione di questo con un gruppo -OH di una struttura a catena aperta (quindi con una minore acidità), determinerà di conseguenza una minore interazione ritentiva con la fase stazionaria. Più complessa è la definizione degli equilibri che regolano in HPAEC il processo ritentivo dei disaccaridi, trisaccaridi e più in generale degli oligosaccaridi e polisaccaridi. Per serie omologhe di oligosaccaridi si osserva in generale un incremento della ritenzione direttamente proporzionale alle dimensioni dell'oligosaccaride.
Le separazioni di carboidrati mediante sistemi cromatografici HPAEC, in congiunzione con la rivelazione in amperometria pulsata, sono realizzate impiegando colonne cromatografiche polimeriche, specifiche per questo tipo di separazioni. Quattro sono le colonne in commercio prodotte dalla Dionex Corporation (USA), espressamente dedicate alla separazione di carboidrati mediante HPAEC-PAD. Le colonne denominate CarboPac PA1 e CarboPac PA100 sono colonne polimeriche di tipo pellicolare. La prima è realizzata per separare monosaccaridi ed oligosaccaridi lineari, mentre la colonna CarboPac PA 100 è specifica per la separazione di oligosaccaridi più complessi. La colonna CarboPac MA1 è sostanzialmente diversa dalle precedenti. Quest'ultima colonna è realizzata funzionalizzando un supporto polimerico poroso e presenta una capacità di scambio (1.45 meq. per colonna) decisamente superiore a quella delle colonne della serie CarboPac. Questa colonna è specifica per la separazione di alditoli. Infine, la colonna denominata CarboPac P10 presenta caratteristiche simili alla CarboPac PA1 ed è commercializzata come una colonna specifica per la separazione di mono e disaccaridi, i quali possono essere selettivamente eluiti impiegando come fase mobile soluzioni estremamente diluite di sodio idrossido, ovvero impiegando acqua come fase mobile, previo opportuno condizionamento della colonna cromatografica con una soluzione alcalina sufficientemente concentrata (ad esempio NaOH 300 mM). Quando si utilizzano fasi mobili alcaline a concentrazioni diluite, si verifica più facilmente la ritenzione in colonna di ioni carbonato, quali possibil interferenti presenti nella fase mobile a causa dell'eventuale anidride carbonica disciolta nell'eluente. Ciò rende necessario rigenerare la colonna ad ogni corsa cromatografica, impiegando un eluente a maggiore forza ionica in grado di rimuovere gli ioni carbonato. Questo inconveniente è ben noto a quanti operano in cromatografia ionica. La preparazione manuale delle soluzioni alcaline, nonostante tutte le precauzioni che si possono prendere, può condurre ad una notevole instabilità dei tempi di ritenzione, a causa della progressiva diminuzione della capacità di scambio della colonna. La presenza di carbonati nella fase mobile può verificarsi per contaminazione diretta dai reagenti impiegati (ad esempio sodio idrossido carbonatato), da un insufficiente degasaggio dell'acqua deionizzata impiegata nella preparazione delle soluzioni, o per assorbimento dell'anidride carbonica atmosferica. Recentemente è stato proposto un apparecchio in grado di produrre on-line per via elettrolitica gli eluenti utilizzati nelle separazioni IC; potassio idrossido nelle separazioni di anioni, acido metansolfonico nelle separazioni di cationi (Dionex, EG40 eluent Generator System). Tale congegno, che può essere considerato l'equivalente per la cromatografia ionica dei sistemi elettrolitici generatori di idrogeno impiegati in gascromatografia, consente di produrre direttamente soluzioni di potassio idrossido da impiegare come fase mobile, in un range di concentrazione da 0 a 100 mM.

Separazione e caratterizzazione di FOS e inulina mediante HPAEC-PAD
Sono stati ottimizzati diversi metodi HPAEC-PAD, per soddisfare le variegate esigenze separative in cui sono coinvolti FOS ed inulina. Diversi programmi di eluizione a gradiente sono stati messi a punto avvalendosi sia della colonna CarboPac PA100, espressamente disegnata per la separazione di oligo- e polisaccaridi, sia della colonna CarboPac PA10, che presenta una maggiore selettività per mono- e disaccaridi. In figura 3 e 4 sono riportati i profili cromatografici relativi a due prodotti commercializzati come inulina, ottenuti impiegando la colonna CarboPac PA100 con un metodo di eluizione a gradiente secondo le condizioni sperimentali. I singoli carboidrati costituenti inulina e FOS sono stati separati utilizzando il programma di eluizione a gradiente lineare a steps. Le condizioni iniziali prevedono l'impiego di una fase mobile a moderata forza ionica (5 mM sodio acetato in 60 mM sodio idrossido, in modo isocratico peri primi 5 minuti), al fine di consentire l'eluizione selettiva del glucosio, fruttosio, saccarosio e della frazione oligosaccaridica a più basso peso molecolare. La separazione dei carboidrati a più alto grado di polimerizzazione è realizzata per mezzo dei due successivi steps di eluizione in gradiente, in cui è linearmente incrementato il pH e la concentrazione degli ioni acetato, seguito da 10 minuti di eluizione isocratica alle condizioni finali. La colonna cromatografica è stata successivamente eluita per dieci minuti con sodio idrossido 300 mM e condizionata per quindici minuti alle condizioni iniziali (step 1 del programma di gradiente), prima di eseguire una successiva analisi. Valutando i due cromatogrammi è evidente la diversa distribuzione dei fruttani che compongono le due miscele di inulina. Nel campione riportato in figura 3 è presente la frazione monosaccaridica (glucosio, fruttosio), il disaccaride saccarosio ed una preponderante frazione oligosaccaridica, mentre, sia qualitativamente che quantitativamente, più contenuta è la frazione polisaccaridica. Nel profilo cromatografico del campione riportato in figura 4 è praticamente assente la frazione oligosaccaridica ed il campione di inulina è essenzialmente composto da fruttani ad alto peso molecolare. Ancora più evidenti le differenze riscontrate in prodotti commercializzati come FOS. Il cromatogramma riportato in figura 5 è relativo ad un prodotto contenente, oltre a fruttosio, saccarosio ed 1-kestosio, una frazione di fruttooligosaccaridi a più alto peso molecolare. Tale tipo di prodotto è generalmente ottenuto dalla depolimerizzazione enzimatica di inulina da cicoria.
La rispondenza ad una serie omologa lineare dei vari picchi eluiti, può essere eseguita correlando il logaritmo del tempo di ritenzione al grado di polimerizzazione del fruttooligosaccaride, modificando i metodi di eluizione suggeriti da Koizumi et al. per i gluco-oligosaccaridi. In figura 6 è riportato il cromatogramma di FOS ottenuti mediante una reazione di transfruttosilazione tramite l'enzima b-fruttoossidasi dell'Aspergillus niger su saccarosio.
I prodotti della reazione enzimatica sono una miscela di carboidrati che hanno formula generale GFn con n variabile da 1 a 5. A differenza dei derivati dei FOS dall'inulina, non sono presenti solo carboidrati con il legame caratteristico b (1-2), ma è possibile avere piccole quantità di strutture ramificate. I costituenti principali sono il trisaccaride 1-kestosio, il tetrasaccaride nistosio ed il pentasaccaride fruttosil-nistosio.
La separazione della frazione fruttooligosaccaridica è stata ottenuta avvalendosi di una colonna Dionex CarboPac PA10, che presenta una elevata selettività per carboidrati a basso peso molecolare. Modulando opportunamente la forza ionica della fase mobile, è possibile separare, oltre ai fruttooligosaccaridi da DP 3 a DP 5, anche carboidrati minori, quali tri- e tetra- e pentasaccaridi del fruttosio. I diversi profili cromatografici ottenuti mediante HPAEC-PAD dei campioni esaminati evidenziano come, con la generica indicazione di FOS, siano reperibili in commercio prodotti molto dissimili tra loro. Un ulteriore esempio dell'applicazione dei metodi cromatografici proposti per l'analisi delle diverse tipologie di FOS e fruttani (inulina) addizionati agli alimenti è quello relativo alla determinazione dei FOS contenuti in un latte commerciale arricchito con vitamine, fibre e fermenti probiotici (alimento funzionale simbiotico).
L'etichettatura di tale prodotto riporta unicamente l'indicazione "fibre solubili" e "frutto-oligosaccaridi", senza naturalmente entrare nello specifico, considerato che la normativa vigente, in relazione all'etichettatura dei prodotti alimentari prescrive, riguardo fruttooligosaccaridi ed inulina, possano essere genericamente indicati come "fibra alimentare" o "fibra solubile". I campioni di latte (500 mL), preventivamente diluiti 1:2 con acqua per HPLC, sono stati trasferiti in unità filtranti da centrifuga per ultrafiltrazione, taglio molecolare da 30.000 e centrifugati per 15 minuti a 5.000 giri/minuto. I campioni (20 mL) sono stati quindi direttamente analizzati impiegando i metodi cromatografici espressamente ottimizzati per la caratterizzazione dei vari fruttani studiati. Come riportato in figura 7, il tipo di latte simbiotico analizzato contiene come fibra alimentare FOS del tipo Actilight® (prodotto da Eridania Bèhin-say). La verifica è stata eseguita comparando i profili cromatografici del prodotto in esame con quelli ottenuti analizzando una soluzione acquosa di Actilight e con una miscela di glucosio, fruttosio, saccarosio, lattosio ed 1-kestosio preparata in laboratorio. Gli analiti sono stati separati mediante un programma di eluizione a gradiente, in cui la fase mobile è costituita da sodio acetato in sodio idrossido, avvalendosi della colonna cromatografica CarboPac PA10.
Il cromatogramma riportato in figura 8-A è relativo ad un campione di latte funzionalizzato con inulina. In questo caso è evidente come l'ingrediente inulina (fig. 8-B), impiegato per conferire al latte caratteristiche dietetiche prebiotiche, presenta dimensioni molecolari ben diverse da quelle del prod tto dell'esempio precedente. La caratterizzazione di tali prodotti (latte dietetico e relativa inulina) è stata in questo caso realizzata avvalendosi di una colonna CarboPac PA100 impiegando un programma di eluizione a gradiente.
Nell'ambito di un programma di ricerca, in parte condotto in collaborazione con partner privato, finalizzato alla separazione e caratterizzazione di alcune sostanze naturali di interesse nel campo dei nutraceutici e degli alimenti funzionali, abbiamo messo a punto dei metodi cromatografici innovativi per la separazione e caratterizzazione di flavonoidi ed antociani. In particolare, nella caratterizzazione di nuovi integratori alimentari contenenti nel loro formulato flavonoidi da agrumi con spiccate attività antiossidanti, (quali naringina, esperidina ed esperetina) e fruttani (Flavofruct®, Lemuria). Il cromatogramma riportato in figura 9 è relativo alla frazione dei fruttooligosaccaridi e fruttani aggiunti nella preparazione degli estratti secchi vegetali omogenei, ottenuti mediante tecnica spray-dry. La caratterizzazione del prodotto è stata eseguita mediante determinazione quantitativa dei flavonoidi tramite metodica HPLC a fase inversa espressamente ottimizzata, che prevede l'impiego di una colonna narrow-bore C18 e rivelatore spettrofotometrico a fotodiodi. Il contenuto quantitativo in fruttani è stato determinato mediante la realizzazione di rette di taratura, eseguite correlando le aree dei picchi eluiti, il cui tempo di ritenzione è compreso tra 9 e 60 minuti, con soluzioni di fruttani a concentrazione nota.

Conclusioni
I dati riportati nella presente comunicazione evidenziano la notevole versatilità della cromatografia ad alta risoluzione a scambio anionico forte, in congiunzione con la rivelazione in amperometria pulsata (HPAEC-PAD), nel separare una vasta gamma di fruttooligosaccaridi e fruttani, carboidrati di particolare interesse nell'ambito degli alimenti funzionali. Le colonne polimeriche reperibili in commercio sono altamente specifiche e consentono di separare mono- oligo- e polisaccaridi. La possibilità di realizzare opportuni gradienti di eluizione, variando la composizione e la forza eluotropa della fase mobile, consente di modulare la selettività delle colonne cromatografiche secondo le diverse esigenze separative.
Infine, ma non certo ultimo, il vantaggio di disporre di un rivelatore quale l'amperometrico pulsato, specifico ed altamente sensibile per questa classe di composti, rende la tecnica HPAEC-PAD di particolare efficacia nella determinazione e caratterizzazione di questa variegata classe di carboidrati.

EFFETTI NUTRIZIONALI DEI FOS ED INULINA

• Aumentano il peso e il volume fecale
• Aumentano la frequenza nelle evacuazioni
• Aumentano il peso del muco del colon
• Aumentano l'assorbimento minerale
• Aumentano la microflora fecale (stimolazione dei Bifidus)
• Aumentano il rapporto HLD/LDL
• Diminuiscono gli effetti costipativi
• Diminuiscono il pH fecale e quindi dei metaboliti tossici e carcinogenici
• Diminuiscono i lipidi nel siero
• Diminuiscono il colesterolo del sangue
• Diminuiscono la pressione sanguigna
• Diminuiscono la risposta glicemica

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Fonte: dal web http://www.lab2000.com

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